GFP綠色熒光蛋白基因標記的觀察方法

GFP是什么？GFP 綠熒光蛋白(Green Fluorescent Portein，GFP)

綠色熒光蛋白是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內的生物發光蛋白，當受到紫外或藍光激發時，發射綠色熒光。其特點在于：它產生熒光無需底物或輔因子，發色團是其蛋白質一級序列固有的來源于水母的氨基酸殘基組成。水母的綠色熒光蛋白很穩定，無種屬限制，已在多種動植物細胞中表達成功并產生熒光。GFP 的熒光受外界的影響較小，另外GFP 的檢測十分方便，而對細胞的傷害小。

綠色熒光蛋白GFP的發光特性：

GFP吸收的光譜峰值為395nm（紫外），并有一個峰值為470nm的副吸收峰（藍光）；發射光譜峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側峰（Shouder）。雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于該激發光對細胞的傷害小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。此外，GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽（FITC）很相似，兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩定，在激發光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強，特別是在450～490nm藍光波長下穩定。類似的，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標記的熒光抗體高，抗光漂白能力強，因此適用于定量測定與分析。由于GFP熒光的產生不需要任何外源反應底物，因此GFP作為一種廣泛應用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。但因為GFP不是酶，熒光信號沒有酶學放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白，比如螢火蟲熒光素酶等。

綠色熒光蛋白GFP的常規觀察方法有三種：

1.熒光顯微鏡

 熒光顯微鏡(Fluorescence microscope) ： 熒光顯微鏡是以紫外線為光源， 用以照射被檢物體，使之發出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細胞內物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位等。 細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射后可發熒光；另有一些物質本身雖不能發熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經紫外線照射亦可發熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質進行定性和定量研究的工具之一。目前在常用的方法就是采用熒光顯微鏡觀察，熒光顯微鏡在實驗室普及，但不足的是必須采集葉片或動物切片進行觀察，對培養的標本進行破壞，無法進行活體觀察。

2. 紫外光源

采用紫外光源LUYOR-3260UV（又叫紫外線燈、黑光燈 uv lamp，uv light）觀察也非常方便，但如果觀察植物，植物葉片的葉綠色在紫外線燈下也會發出熒光，對gfp發出的熒光也會產生干擾，另外，標本長時間在紫外光源照射下對GFP標本組織也會造成破壞。

3.便攜式GFP激發光源

采用便攜式GFP激發光源LUYOR-3415(又叫熒光蛋白觀測鏡）是便捷、方便的觀察方法，因GFP在470nm有一個很高的吸收峰，采用 470nm激發光源能夠激發GFP發出明亮的綠色熒光，在觀察gfp熒光時，因為激發光為強烈的藍色光線，佩戴專業的觀察眼鏡才能觀察到清晰的熒光信號。推薦使用美國路陽LUYOR-3260便攜式激發光源。因此，使用便攜式GFP激發光源為方便有效的觀察辦法。

熒光蛋白激發光源LUYOR-3415的主要產品應用：

檢測轉綠色熒光蛋白（GFP）基因、紅色熒光蛋白（DsRed）基因植物：水稻、小麥、玉米、大豆、棉花、擬南芥

檢測轉GFP、DsRed基因動物：小鼠、兔子、猴子等；

檢測轉GFP、DsRed基因微生物：細菌、真菌、酵母等；

檢測GFP、DsRed基因組織特異性表達；